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瀏覽數(shù)量： 0 作者： 本站編輯 發(fā)布時(shí)間： 2022-07-05 來源： 本站
新冠疫情的爆發(fā)，使得全球卷入了這場沒有硝煙的戰(zhàn)斗中，相較2021年，疫情雖正在往好的方向發(fā)展，但全球確診人數(shù)依然超過5.4億1,2。
等溫?cái)U(kuò)增
核酸檢測是確診 SARS-CoV-2 感染的最主要依據(jù)。目前可用于 RNA 病毒的核酸檢測技術(shù)主要有基因測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、等溫核酸擴(kuò)增等。其中熒光定量PCR檢測方法是首選方案3。
然而反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）的檢測方法需要依賴溫控精度良好的熱循環(huán)儀，并且PCR反應(yīng)中必須的變性、退火和延伸步驟，使整個(gè)擴(kuò)增檢測時(shí)間較長，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2的現(xiàn)場快速檢測4。
核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無需熱循環(huán)儀，擴(kuò)增反應(yīng)效率高、速度快，非常適合于病原體核酸的現(xiàn)場快速檢測。因此不少相關(guān)從業(yè)人員，都曾把核酸快速檢測的希望，寄托于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)上面。
不同等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)優(yōu)劣
不少核酸等溫?cái)U(kuò)增方法已相繼被用于SARS-CoV-2的檢測。包括依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、交叉引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)（CPA）、切刻內(nèi)切酶核酸擴(kuò)增反應(yīng)（NEAR）等。
這些技術(shù)原理各異，產(chǎn)物檢測方法各不相同，造成它們在檢測SARS-CoV-2時(shí)的靈敏度、特異性、靶標(biāo)基因、所需儀器、檢測時(shí)間等方面存在差異。
市面上這幾種等溫?cái)U(kuò)增的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，以下來分析：
SAT是在 NASBA 技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度和特異性，但是并未能從根本上克服NASBA 技術(shù)反應(yīng)時(shí)間長的問題。
熒光RT-RAA法：熒光RAA方法靈敏度較高。但是對(duì)樣品核酸品質(zhì)要求較高，需要搭配傳統(tǒng)的提取方法。并且樣品同一時(shí)間只能檢測單一靶標(biāo)基因。
CPA實(shí)時(shí)熒光法：CPA擴(kuò)增產(chǎn)物采用分子信標(biāo)進(jìn)行檢測，然而這個(gè)方法的通量太小。此外交叉引物的設(shè)計(jì)要求較高，在研發(fā)過程中，引物的篩選和測試，十分繁瑣。這可能會(huì)造成基于該技術(shù)的檢測試劑平臺(tái)開發(fā)周期較長4 。
LAMP芯片法：可利用肉眼觀察顏色變化，或灰度檢測來判讀檢測結(jié)果，雖然降低了對(duì)儀器設(shè)備的要求，適合在資源有限和經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)開展核酸檢測，然而主觀判斷顏色變化存在較大個(gè)體差異5，有可能影響結(jié)果判讀。
除了上述提到的情況外，等溫?cái)U(kuò)增還有以下一些問題
1、樣品前處理（核酸提?。┦堑葴?cái)U(kuò)增一個(gè)主要制約因素。
2、如何實(shí)現(xiàn)單管閉管條件下的多重或多靶標(biāo)等溫?cái)U(kuò)增檢測，并同時(shí)具有高靈敏度和特異性，也是亟待解決的技術(shù)難題。
3、在理論上等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不能夠通過反應(yīng)時(shí)間來指示核酸擴(kuò)增量，這難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的定量檢測，更加適合于半定量或定性檢測。
4、某些等溫?cái)U(kuò)增方法，如 LAMP 等溫?cái)U(kuò)增涉及多個(gè)引物，往往需要通過優(yōu)化引物設(shè)計(jì)來確保核酸檢測的特異性與靈敏度，這提高了其技術(shù)實(shí)現(xiàn)難度8。
現(xiàn)階段而言，某些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有一定現(xiàn)場應(yīng)用的前景，然而目前的產(chǎn)品通量偏低，時(shí)間偏長和靈敏度偏低，還是限制了這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用場景7。這些缺點(diǎn)限制了等溫?cái)U(kuò)增的發(fā)展，也造成了等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)空有好的設(shè)想?yún)s遲遲無法落地的困境。
那有沒有既兼具了等溫?cái)U(kuò)增快速、儀器簡單的特點(diǎn)，而又有傳統(tǒng)熒光定量PCR特異性好、準(zhǔn)確度高的檢測方法？答案是有的?？焖贌晒舛縋CR就是這個(gè)問題的終極解決方法。它既有傳統(tǒng)熒光定量PCR準(zhǔn)確度高，靈敏度好的特點(diǎn)，而又通過技術(shù)革新，具備比等溫?cái)U(kuò)增更快速完成實(shí)驗(yàn)的能力。
革新
傳統(tǒng)的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)間長，是由于受到儀器升降溫速度，以及傳熱的效率所限，整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間時(shí)長一般為70-120分鐘。
一般來說，熒光定量PCR反應(yīng)的溫度條件是較為固定的，既然無法改變溫度條件，若想提高整個(gè)實(shí)驗(yàn)的速度，那么只能從兩方面著手進(jìn)行優(yōu)化：一是提升溫控性能，二是提高熱傳遞效率。百泰克公司歷時(shí)三年研發(fā)的PCR儀，就是從這兩方面入手，打破傳統(tǒng)熒光PCR反應(yīng)時(shí)間的枷鎖，為整個(gè)熒光定量PCR技術(shù)帶來革新。
百泰克快速熒光定量PCR儀BTK-8，采用先進(jìn)的升降溫模塊，升降溫可達(dá)12℃/s，平均升降溫速度為10℃/s，為傳統(tǒng)熒光PCR儀的3-5倍。由于變溫PCR反應(yīng)時(shí)，溫度需要從58℃提升至95℃，再降至58℃，如此循環(huán)40~45次，因此升降溫速率的提升可將原本70-120min的檢測提速至20~30min完成。
耗材方面，BTK-8摒棄了傳統(tǒng)的0.1ml、0.2ml PCR反應(yīng)管，采用新型的注塑工藝與柔性膜結(jié)合技術(shù)，研發(fā)芯片式反應(yīng)耗材，適合大規(guī)模機(jī)械化生產(chǎn)，成本進(jìn)一步降低。
單個(gè)芯片包含有10個(gè)獨(dú)立的樣品孔，芯片加樣孔較小，不容易與空氣進(jìn)行交換，從而大大降低了孔洞間的氣溶膠交叉污染的可能性，檢測體系具有超高的檢測準(zhǔn)確性，可達(dá)到ABI Q6同等靈敏度，且芯片加樣無需離心去掉氣泡，操作起來更加便捷。
從下表可以看出，現(xiàn)在BTK-8這款快速定量PCR儀，已經(jīng)能把實(shí)驗(yàn)時(shí)間壓縮至30分鐘以下，而且檢測下限能夠達(dá)到200 copies/ml，能滿足現(xiàn)在的檢測需求。相比于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，快速熒光PCR的時(shí)間更短、準(zhǔn)確性更高。
結(jié)語
在過去的時(shí)間內(nèi)，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)憑借其簡單快速、便于在基層單位推廣的特點(diǎn)，在部分人畜共患病、婦科惡性腫瘤、以及多種呼吸道疾病的檢測中發(fā)揮著一定的作用。然而伴隨著BTK-8快速熒光PCR儀的橫空出世，使得相關(guān)的檢測有了一個(gè)更好的選擇。能提供更快捷、準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)結(jié)果的快速熒光定量PCR儀，將會(huì)完美替代等溫?cái)U(kuò)增的檢測手段，在多個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮巨大作用。
特別是在新型冠狀病毒疫情仍然全球流行的時(shí)期，由于各國防控情況不平衡，新型冠狀病毒或?qū)⒃谙喈?dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)與人類共存，甚至有可能會(huì)成為一種長期存在的一種呼吸道傳播病原體。而在口岸快速排查，基層發(fā)熱門診快速分流的實(shí)際需求，均要求能夠提供快速、準(zhǔn)確、有效的實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果。相比于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、BTK-8快速熒光PCR儀則更能滿足這些場景的需求。
